Contenido
- 1 Cultivo de la ruda
- 2 Características destacadas de la ruta graveolens
- 3 Problemas
- 4 Usos del jardín
- 5 El extracto de Ruta Graveolens induce las vías de daño del ADN y bloquea la activación de Akt para inhibir la proliferación y supervivencia de las células cancerosas
- 6 Abstracto
- 7 Materiales y métodos
- 8 Resultados
- 8.1 Inhibición de la viabilidad celular dependiente de la dosis por el extracto de R. graveolens
- 8.2 El extracto de Ruta graveolens inhibe la proliferación de células cancerosas
- 8.3 El extracto de R. graveolens activa la vía p53
- 8.4 El extracto de R. graveolens induce la vía de respuesta al daño del ADN
- 8.5 El extracto de R. graveolens induce la activación de caspasas
- 9 Discusión
- 10 Expresiones de gratitud
- 11 Referencias
Nombre común: rudaCultivo de la ruda
Se cultiva fácilmente en suelos moderadamente fértiles, secos a medianamente húmedos, bien drenados a pleno sol. Las plantas toleran un poco de sombra ligera. Las plantas también toleran suelos pobres siempre que tengan un buen drenaje. Tolerante a la sequía una vez establecido. Las plantas se desempeñan bien en sitios cálidos y secos. Evite los suelos húmedos. El mantillo de invierno es importante en las partes del norte del rango de crecimiento de esta planta. Pode las plantas hasta que queden madera vieja a principios de la primavera. Propagar por semillas o esquejes.
Características destacadas de la ruta graveolens
Ruta graveolens, comúnmente llamada ruda, es originaria del sur de Europa. Es una planta perenne arbustiva, glabra, glauca, de base leñosa, con hojas compuestas aromáticas, parecidas a helechos. Por lo general, crece en un montículo hasta 2-3 ‘de altura. En algunas partes de los Estados Unidos (particularmente en el noreste), se ha escapado de los jardines y se ha naturalizado a lo largo de caminos, campos y áreas alteradas. A pesar de sus muchos usos históricos, hoy en día se cultiva principalmente con fines ornamentales. Las hojas de color verde azulado pinnadas (hasta 3-5 ”de largo) tienen segmentos alargados / espatulados. El follaje tiene un aroma acre cuando se golpea y las hojas tienen un sabor amargo. Las flores pequeñas, de 4 a 5 pétalos, de color amarillo apagado en racimos (corimbos aplanados) florecen sobre el follaje a principios del verano. La fruta es una cápsula de semillas de color marrón. El valor ornamental radica en el delicado follaje verde azulado. La ruda se utilizó históricamente para una gran cantidad de fines medicinales, pero las preocupaciones sobre la eficacia y la seguridad ahora desalientan tales usos. Las hojas son tóxicas si se ingieren. La manipulación de plantas puede provocar dermatitis.
El nombre del género proviene de la palabra latina que significa amargura o desagrado.
Epíteto específico significa perfumado celestial.
Problemas
Sin problemas graves de insectos o enfermedades. Puede ocurrir pudrición de la raíz, particularmente en suelos con mal drenaje. Use mangas largas y guantes al podar o manipular el follaje.
Usos del jardín
Muros, jardines de rocas y jardines de hierbas. Interesante planta de cantos bajos.
El extracto de Ruta Graveolens induce las vías de daño del ADN y bloquea la activación de Akt para inhibir la proliferación y supervivencia de las células cancerosas
Abstracto
Antecedentes
Ruta graveolens es una hierba medicinal que se ha utilizado durante siglos contra diversas dolencias. Este estudio examinó las propiedades anticancerígenas de la hierba utilizando líneas de células cancerosas.
Materiales y métodos
El extracto metanólico de R. graveolens se probó en células cancerosas de colon, mama y próstata. Se midieron la viabilidad, los perfiles del ciclo celular, la clonogenicidad y la activación de capasa. Se examinaron las localizaciones subcelulares y de inducción de las proteínas p53, 53BP1 y γ-H2AX.
Resultados
el extracto disminuyó de forma dependiente de la dosis la viabilidad y la clonogenicidad de las células tratadas e indujo la detención de G2 / M, mitosis aberrantes y activación de caspasa-3. También indujo la vía p53 y la concentración focal de las proteínas de respuesta al daño del ADN 53BP1 y γ-H2AX. Además, los niveles de fosfo-Akt y ciclina B1 se redujeron con el tratamiento, mientras que solo la ciclina B1 se redujo en los fibroblastos dérmicos normales.
Conclusión
El extracto de R. graveolens contiene compuestos bioactivos que, independientemente de los mecanismos fotoactivables conocidos, inhiben de forma potente la proliferación y supervivencia de las células cancerosas a través de múltiples objetivos.
Las plantas son fuentes importantes de compuestos medicinales en todo el mundo. Unos pocos ejemplos son: aspirina de sauce, digitalis de dedalera, la artemisinina de ajenjo, taxol del tejo del Pacífico árbol, vinblastina y vincristina de bígaro, etopósido de mayapple, etc . Más del 60% de las terapias contra el cáncer en el mercado o en ensayos preclínicos se basan en productos naturales ( 1 , 2 ). A pesar del declive del interés de la industria farmacéutica en la investigación y el desarrollo de compuestos naturales, estos compuestos sin refinar de fuentes terrestres y acuáticas continúan sirviendo como base química de la que se pueden derivar versiones modificadas o sintéticas.
Ruta graveolens es una planta medicinal y culinaria originaria de la región mediterránea del sur de Europa y norte de África. Ampliamente cultivada en diferentes partes del mundo, esta hierba se ha utilizado históricamente desde la antigüedad ( 3 ). Sus usos terapéuticos documentados incluyen el tratamiento de afecciones inflamatorias, eccema, úlceras, artritis, fibromialgia, antídoto para venenos, repelente de insectos y como abortivo ( 4 – 6 ). La planta también se ha utilizado comúnmente para condimentar algunos alimentos como sopa, queso, mantequilla, café y té, y en preparaciones medicinales como aceite de ruda e infusiones que se utilizan como antiespasmódicos y emenagogos ( 7 ).
Los compuestos químicos que hasta ahora se sabe que están presentes en R. graveolens incluyen furanocumarinas, carotenoides, clorofila y furanoquinolonas ( 4 , 8 ). Los psoralenos, una familia de furanocumarinas en R. graveolens , han sido ampliamente estudiados por su actividad de reticulación entre cadenas de ADN cuando se exponen a luz ultravioleta (UV). Esta propiedad de fotoactivación de los psoralenos se ha utilizado en el tratamiento de diversas neoplasias malignas de la piel que incluyen psoriasis, vitiligo y linfoma cutáneo como un régimen de psoraleno más UV-A o UV-B (PUVA o PUVB) ( 9 – 11 ).
Aunque se ha sugerido que algunos componentes bioactivos de los extractos e infusiones de hierbas elaborados a partir de la planta de la hierba R. graveolens son responsables de los efectos beneficiosos o fototóxicos de la planta, los estudios moleculares que descifran ampliamente las actividades de la mayoría de sus ingredientes bioactivos son escasos. Si bien la fitofototoxicidad causada por R. graveolens se conoce desde hace mucho tiempo, las bioactividades de los extractos de R. graveolens o sus diversas preparaciones contra células tumorales o microbios patógenos han atraído la atención solo recientemente ( 12 – 17 ).
Este estudio examinó la potencia de un extracto de R. graveolens en líneas celulares cancerosas. Este estudio muestra que este extracto tiene una potente actividad anticancerígena, que se manifiesta a través de fuertes efectos antiproliferativos y de supervivencia en las células cancerosas.
Materiales y métodos
Cultivo celular y tratamientos
La línea celular de cáncer colorrectal humano HCT116 fue una generosa donación del Dr. Bert Vogelstein (Universidad Johns Hopkins, MD, EE. UU.). La línea celular se mantuvo en medio de McCoy (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 10.000 U / ml de penicilina / 10 mg / ml de estreptomicina. La línea celular MCF7 fue un regalo del Dr. Leslie Wilson (Universidad de California en Santa Bárbara, CA, EE. UU.). Se cultivaron células RKO (adquiridas en ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) Y MCF7 en medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, EE. UU.) Suplementado con FBS y penicilina / estreptomicina. Las líneas celulares de cáncer de próstata PC3 y DU-145, adquiridas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.), Se cultivaron en medio T (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, EE. UU.), Complementado con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina. Para los tratamientos experimentales, las células se sembraron en placas con 96 pocillos (para ensayos de viabilidad), 12 pocillos (para ensayos de formación de colonias), 6 pocillos (para citometría de flujo y ensayos de clonogenicidad), placas de cultivo de 6 cm (para preparaciones de lisado celular ) o portaobjetos de cámara de 4 pocillos (para tinción por inmunofluorescencia). Todos los cultivos celulares se incubaron a 37 ° C y 5% CO2 en una incubadora humidificada.
Preparación de extracto
Se trituraron finamente hojas frescas de Ruta graveolens en un procesador de alimentos y se extrajeron en metanol al 80% durante 24 horas. Las partículas en suspensión se eliminaron mediante dos rondas de centrifugación a 1000 × gy 10,000 × g durante cinco y diez minutos, respectivamente. La fracción soluble se desecó en un rotavapor y los sólidos evaporados se resuspendieron en DMSO a una concentración final de 60 mg / ml.
Anticuerpos
Se adquirieron anticuerpos anti-p53, β-actina, fosfo-γ-H2AX ser139, 53BP1, Akt, fosfo-Akt, ciclina B1, CDK1 de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). El anti-p21 WAF1 se adquirió de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EE. UU.). El anticuerpo monoclonal para la α-tubulina (clon DM1A) se adquirió de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.).
Ensayos de clonogenicidad
El ensayo de clonogenicidad se realizó como se describe en otra parte ( 18 ). El potencial clonogénico de las células tratadas y no tratadas se determinó sembrando aproximadamente 150 células por pocillo de una placa de 6 pocillos. Se dejó que las células se adhirieran durante aproximadamente 24 horas y luego se trataron con concentraciones variables (0-300 μg / ml) de R. graveolensextraer en medio de cultivo. La formación de colonias se examinó diariamente mediante microscopía óptica. El ensayo se terminó fijando las células cuando las células tratadas de control formaron colonias discretas visibles. Las colonias formadas se tiñeron con violeta cristal al 10% en metanol durante 15 a 20 minutos, se lavaron para eliminar el exceso de tinte y se secaron al aire. Las colonias se contaron usando AlphaImager (AlphaInnotech, Santa Clara, CA, EE. UU.) En el modo de conteo de colonias. La clonogenicidad relativa de las células tratadas se calculó como porcentaje del número de colonias que se formaron en los pocillos tratados con DMSO de control.
Citometría de flujo
Las células se recolectaron y prepararon para la citometría de flujo como se describe en otra parte con algunas modificaciones ( 19). Las células se recogieron mediante tripsinización usando tripsina-EDTA al 0,25% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se centrifugaron. Los sedimentos se resuspendieron en 300 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, EE. UU.), Se fijaron mediante la adición de 700 μl de etanol al 100% mientras se agitaban en vórtex y se almacenaron a -20 ° C durante un mínimo de 12 horas. Las células fijadas se centrifugaron y se tiñeron en solución de tinción FACS (320 mg / ml de ARNasa A, 0,4 mg / ml de yoduro de propidio) en PBS sin calcio y magnesio durante 15 minutos a 37ºC. Las células teñidas se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 70 µm y se analizaron mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo C6 Accuri® (Accuri Cytometers, Ann Arbor, MI, EE. UU.). Los datos se analizaron y los histogramas se prepararon utilizando el software CFlow ™ (Accuri Cytometers, Ann Arbor, MI, EE. UU.).
Tinción y microscopía inmunofluorescentes
Se tomaron imágenes de contraste de fase de las células con objetivos de aumento de 20X y 40X (y ocular de 10X) utilizando un microscopio invertido Olympus IX71 (Olympus America Inc, Melville, NY, EE. UU.) Equipado con cámaras de captura de imágenes digitales (Laboratorio de microscopía digital, Facultad de Medicina Veterinaria). , Enfermería y Salud Aliada, Universidad de Tuskegee). Se cultivaron células HCT116 para tinción inmunofluorescente en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. La tinción se realizó como se describió anteriormente ( 19). Las imágenes confocales se tomaron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio Olympus DSU (Olympus America Inc, Melville, NY, EE. UU.) En el centro de investigación del Centro de Investigación en Instituciones Minoritarias (RCMI) utilizando un objetivo seco de 40X. Las imágenes se capturaron utilizando el software Metamorph Premium (Strategic Triangle Inc, Toronto, Canadá), se almacenaron en formato TIFF y se procesaron posteriormente en Adobe Photoshop.
Inmunotransferencia
Se prepararon lisados celulares en tampón de lisis NP-40 (Tris-Cl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 10% y cóctel de inhibidor de proteasa NP-40 al 0,2%) y se determinaron las concentraciones de proteínas utilizando un ensayo de proteínas compatible con detergente DC (BioRad Laboratories Inc, Hercules, CA, EE. UU.). Las muestras que contenían concentraciones de proteína equivalentes se mezclaron con tampón de Laemmli y se hirvieron durante cinco minutos. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, EE. UU.) Y se bloquearon en leche desnatada en polvo al 5%. Se usaron anticuerpos primarios (p53, p21 y ciclina B1) a diluciones 1: 1000. Se adquirieron anticuerpos secundarios IgG anti-conejo y anti-ratón conjugados con peroxidasa de GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ, EE.UU.) y se usaron a una dilución 1: 5000.
Ensayo de activación de caspasa 3
El ensayo se realizó utilizando un kit de ensayo de activación colorimétrico de Caspasa 3 (Caspase-3-C, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). Brevemente, las células tratadas y de control se lisaron en tampón de lisis 1X. Se utilizaron treinta microgramos de proteína total para realizar el ensayo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se añadió Caspasa 3 recombinante a lisados de células no tratadas (control) y se utilizó como control positivo para el ensayo. Se incubó un conjunto separado de células con estaurosporina 1 µM durante tres horas para activar la caspasa 3 endógena como otro control. La absorbancia se leyó en modo cinético cada 1,5 minutos a 405 nm utilizando el lector de placas PowerWave XS y el software Gen5 (Biotek Instruments Inc, Winooski, VT, EE. UU.).
Resultados
Inhibición de la viabilidad celular dependiente de la dosis por el extracto de R. graveolens
Para determinar la bioactividad de un extracto metanólico de R. graveolens contra células cancerosas, se trataron células cancerosas HCT116 (cáncer colorrectal), MCF7 (cáncer de mama), DU-145 y PC3 (ambos cáncer de próstata) con concentraciones variables del extracto y se examinaron la viabilidad en las células tratadas frente a las de control mediante el ensayo MTS después de 24 horas.
Como se muestra en Figura 1A, El extracto de R. graveolens redujo la viabilidad de las células cancerosas tratadas de una manera dependiente de la dosis. Basándose en la viabilidad celular medida después de solo 24 horas, la concentración inhibitoria aproximada del 50% (IC 50 ) del extracto de R. graveolens fue de aproximadamente 75 μg / ml (células PC3), 150 μg / ml (MCF7), 200 μg / ml ( HCT116), 300 μg / ml (células DU-145), siendo las células PC3 las más sensibles. Sin embargo, como se describe a continuación, la formación de colonias por las líneas celulares fue completamente inhibida por dosis aún más pequeñas del extracto, lo que sugiere una concentración inhibidora del crecimiento efectiva aún más baja del extracto.
A. Se expusieron células cancerosas PC3 (próstata), DU-145 (próstata), HCT116 (colorrectal) o MCF7 (mama) a concentraciones variables de extracto de R. graveolens. La viabilidad de las células tratadas de control (sin tratar o DMSO) o experimentales (extracto de R. graveolens de 37 μg / ml a 600 μg / ml) se evaluó después de 24 horas (ensayo de viabilidad celular MTS, Promega Corp., Madison, WI, EE. UU.) Absorbancia se leyó a 490 nm usando un lector de microplacas PowerWave XS (BioTek, Winooski, VT, EE.UU.). B. Ensayo de clonogenicidad en células HCT116, RKO y DU-145 tratadas con extracto de R. graveolens. Las líneas de células cancerosas se trataron con las concentraciones indicadas (µg / ml de medio de cultivo) de extracto de R. graveolens y se evaluaron sus clonogenicidades como se describe en los materiales y métodos.
El extracto de Ruta graveolens inhibe la proliferación de células cancerosas
A diferencia de las células normales, las células cancerosas tienen la capacidad de proliferar y formar colonias celulares incluso cuando se siembran como células individuales después de separarse de otras células cancerosas o del estroma. Se evaluó mediante un ensayo de formación de colonias si el extracto de R. graveolens inhibiría la capacidad de las células cancerosas HCT116, RKO o DU-145 para establecer colonias celulares a partir de células individuales. Como se muestra en Figura 1B, la capacidad de formación de colonias de todas las células cancerosas probadas fue inhibida por el extracto de R. graveolens . La formación de colonias se inhibió casi en un 100% en todas las líneas celulares a la dosis de 60 µg / ml. La incapacidad de las células para formar colonias indica la presencia de compuestos antiproliferativos muy potentes en el extracto.
La detención del ciclo celular es uno de los mecanismos por los que se bloquea la proliferación celular. Las células estresadas, que poseen puntos de control funcionales del ciclo celular, activan la detención del ciclo celular, lo que permite que las células se recuperen del estrés antes de la división celular. Para examinar el efecto del extracto de R. graveolens en el ciclo celular, se trataron células de cáncer de mama MCF7 con vehículo (control), 37 μg / ml, 75 μg / ml o 150 μg / ml de extracto durante 24 horas y el perfil del ciclo celular de las células se analizó mediante citometría de flujo. Como se muestra enFigura 2A-B, las células tratadas con extracto de R. graveolens se detuvieron principalmente en las fases tardías S a G2 / M del ciclo celular. Las células HCT116 y DU-145 también mostraron una detención del ciclo celular similar (datos no mostrados). Además de la detención del ciclo celular, también se observó que las células tratadas con extracto de R. graveolens también mostraron un mayor número de mitosis aberrantes e integridad nuclear posmitótica, particularmente cuando se expusieron a dosis más altas del extracto. La proporción de mitosis aberrantes observadas para las células HCT116 se muestra enFigura 2C. De manera similar, MCF7 y otras células tratadas también mostraron una mayor tasa de mitosis aberrante a dosis similares. Estos fenotipos aberrantes incluían husos tripolares o multipolares, fibras de huso cortas o desordenadas, cromosomas rezagados en la transición metafase-anafase y formación de micronúcleos. Estos datos sugieren que la detención del ciclo celular y la interrupción de la mitosis son dos de los mecanismos por los que los compuestos del extracto de R. graveolens inhiben la proliferación celular.
Detención del ciclo celular y fenotipos aberrantes de división celular inducidos por extracto de R. graveolens. A. detención del ciclo celular en células MCF7. B. Gráfico de barras que muestra la proporción de mitosis aberrantes en células HCT116 de control y tratadas.
El extracto de R. graveolens activa la vía p53
Varios estresores celulares inducen la estabilización y activación de la proteína supresora de tumores p53. La proteína p53 regula los mecanismos celulares críticos que modulan el ciclo celular, la apoptosis, la senescencia y diversas vías de señalización. Por tanto, se examinó si la proteína p53 se activa tras el tratamiento de células con extracto de R. graveolens . Se trataron células de cáncer colorrectal HCT116, que tienen una vía p53 intacta, con el extracto y se examinó la inducción de p53 mediante tinción de inmunofluorescencia. Como se muestra enFiguras 3A y B, la exposición de las células HCT116 al extracto de R. graveolens , pero no al vehículo DMSO, condujo a la acumulación de p53 nuclear. La inducción de p53 también estuvo acompañada por la inducción de la proteína inhibidora de CDK reguladora del ciclo celular p21 (Figura 3B), que indica la activación de la transcripción mediada por p53. Esta actividad transcripcional sugiere que los compuestos en el extracto de R. graveolens activan las vías reguladas por p53, que incluyen la detención del ciclo celular que puede ser mediada por la proteína p21.
A. Inducción de la proteína supresora de tumores p53 por extracto de R. graveolens. Se trataron células HCT116 con control de vehículo (DMSO) o las concentraciones indicadas del extracto de R. graveolens en medio de cultivo durante 24 horas. La p53 nuclear se visualizó mediante tinción inmunofluorescente usando anticuerpos anti-p53 y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa-fluor (rojo). Las células se tiñeron por contraste con anticuerpo anti-tubulina (verde). Los paneles del extremo derecho muestran imágenes fusionadas en rojo y verde. B. Inmunotransferencia para mostrar la inducción de la proteína p53 y su diana transcripcional p21. Se utilizó etopósido como control positivo para la inducción de p53 en células HCT116. C. Inducción de focos de respuesta al daño del ADN (DDR) en células tratadas con R. graveolens. Las células HCT116 se expusieron al control (portador DMSO) o R. graveolens durante 24 horas y se analizó la distribución nuclear de la proteína 53BP1 mediante tinción inmunofluorescente utilizando anticuerpos anti-53BP1 y anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con Alexa-fluor (rojo). Los núcleos se contratiñeron usando DAPI. Los paneles del extremo derecho muestran imágenes fusionadas en rojo y azul. D. Inducción de la fosforilación de γ-H2AX por extracto de R. graveolens. Se trataron células HCT116 como se muestra y se examinó la distribución nuclear de la proteína 53BP1 mediante tinción inmunofluorescente.
El extracto de R. graveolens induce la vía de respuesta al daño del ADN
La proteína supresora de tumores p53 puede activarse mediante señales que se originan en la respuesta al daño del ADN activado (DDR) ( 20 , 21 ). ATM, Chk1, Chk2, p53, 53BP1, el complejo MRN y otras proteínas son componentes de la red de señalización DDR. 53BP1 es una proteína grande (450 kDa) que se identificó inicialmente por su capacidad para unirse a p53. Estudios posteriores han demostrado que la proteína 53BP1 es parte del complejo proteico de respuesta al daño del ADN (DDR) y se localiza conjuntamente con las proteínas del complejo de reparación del ADN como Mre11-Rad50-NBS1 (MRN) en distintos focos nucleares ( 22 – 26 ) .
Para examinar si la activación de la vía p53 fue el resultado de la señalización DDR, se analizaron las distribuciones nucleares de las proteínas 53BP1 y γ-H2AX mediante tinción con inmunofluorescencia con CE de las células HCT116 de control o de R. graveolens tratadas 24 horas después de la exposición al extracto. Como se muestra enFigura 3C y D, el tratamiento con extracto de R. graveolens indujo la activación y el reclutamiento de proteínas 53BP1 y γ-H2AX en distintos focos nucleares, típicamente evidentes en la respuesta celular al daño del ADN. La relocalización de las proteínas 53BP1 y γ-H2AX en focos subnucleares indica que los compuestos de R. graveolens tienen la capacidad de inducir focos de daño del ADN, a los que se reclutan proteínas reparadoras de daños.
La proteína Akt / PKB es una molécula de señalización a favor de la supervivencia activada constitutivamente en varios tumores sólidos y se cruza con la vía p53 ( 27 ). Para examinar si el extracto de R. graveolens modula esta vía de señalización crítica, se examinó la fosforilación de la proteína Akt como marcador de activación de Akt en células de cáncer de próstata DU145. Como se muestra enFigura 4A, el tratamiento de las células con extracto de R. graveolens redujo los niveles de fosfo-Akt, lo que sugiere que el extracto puede inhibir la actividad de la vía de señalización de Akt. En contraste con la Akt fosforilada, los niveles celulares totales de la proteína Akt no se vieron afectados por el tratamiento. Además, el nivel de ciclina mitótica B1 se redujo significativamente por R. graveolensextracto, que indica además el efecto inhibidor del extracto sobre la transición del ciclo celular. Para examinar el efecto del extracto de R. graveolens sobre las células no transformadas, se trataron fibroblastos dérmicos humanos normales con el vehículo o el extracto. Curiosamente, a diferencia de las líneas de células cancerosas, no se observaron cambios importantes en los niveles de fosfo-Akt y p53 en los fibroblastos expuestos a hasta 150 μg / ml del extracto (Figura 4B). Sin embargo, los niveles de ciclina B1 se redujeron notablemente en los fibroblastos tratados, de manera similar a las células cancerosas. Las dosis superiores a 150 μg / ml del extracto fueron citotóxicas no específicamente también para los fibroblastos.
El extracto de AR graveolens suprime la activación de Akt y los niveles de ciclina-B1. Se trataron células de cáncer de próstata DU145 solo con portador o con extracto de R. graveolens 150 µg / ml durante 48 horas. La expresión de las proteínas indicadas se analizó mediante inmunotransferencia. B. Se trataron fibroblastos dérmicos humanos normales con las concentraciones indicadas de extracto de R. graveolens durante 48 horas. Los paneles indican la expresión de las proteínas indicadas evaluadas por inmunotransferencia.
El extracto de R. graveolens induce la activación de caspasas
Durante los experimentos, se observó que la reducción en la viabilidad celular o la inducción de la muerte celular se asoció con un mayor número de células con ampollas en la membrana, que es un fenotipo microscópico característico de las células que experimentan apoptosis. Esto fue especialmente evidente en células expuestas al extracto de R. graveolens a dosis entre 150 µg / ml y 300 µg / ml durante 24 horas.Figura 5Amuestra el aspecto microscópico de las células HCT116 tratadas con DMSO (control) o 300 μg / ml de extracto de R. graveolens . Para examinar si el fenotipo de ampollas de membrana también se asoció con la activación de caspasas intracelulares, la actividad de caspasa 3 en los lisados de células HCT116 tratadas con DMSO, o 75 μg / ml, 150 μg / ml o 300 μg / ml de R. Se ensayó el extracto de graveolens . Paralelamente, las células HCT116 se trataron con estaurosporina 1 µM durante tres horas como control positivo para inducir la caspasa 3 endógena. Se usó la caspasa 3 recombinante como control de ensayo. Como se muestra enFigura 5B, la actividad de la caspasa 3 en los lisados de las células tratadas con 150-300 μg / ml de extracto de R. graveolens mejoró notablemente en comparación con las células de control. Este resultado confirmó que el fenotipo de ampollamiento de la membrana observado en las células tratadas con extracto de R. graveolens fue coincidente con la ejecución de la apoptosis, y la inducción del fenotipo apoptótico se correlacionó con una actividad de caspasa intracelular mejorada.
Activación de caspasa 3 e inducción de apoptosis por extracto de R. graveolens. A. Se trataron células HCT116 durante 24 horas con el portador DMSO o 300 µg / ml de extracto de R. graveolens en medio de cultivo. Se tomaron imágenes de contraste de fase de las células tratadas con aumentos de 200X o 400X. B. Se trataron células HCT116 con portador DMSO, extracto de R. graveolens (75 µg / ml, 150 µg / ml o 300 µg / ml) o estaurosporina (STS, 1 µM, 3 horas). El ensayo de activación de caspasa 3 se realizó como se describe en materiales y métodos. Se añadió caspasa 3 recombinante (recCasp3) al extracto de células sin tratar y se ensayó en paralelo, como control de ensayo. La cinética de la actividad de la caspasa se registró como absorbancia a 405 nm.
Discusión
Este estudio mostró que la hierba medicinal y culinaria Ruta graveolens contiene compuestos bioactivos que inhiben la proliferación celular, reducen la viabilidad celular e inducen la respuesta al daño del ADN y la apoptosis. Esto es particularmente interesante ya que esta hierba se ha utilizado durante siglos como ingrediente condimentado para alimentos y para tratar diversas enfermedades. Las preparaciones de R. graveolens pueden obtenerse fácilmente comercialmente como infusiones y aceites para uso medicinal.
Estos datos sugieren que R. graveolensEl extracto contiene compuestos candidatos que merecen ser evaluados no solo por sus mecanismos de acción, sino también por sus potenciales quimioterapéuticos o de terapia adyuvante. Es importante destacar que el tratamiento con el extracto indujo la formación de focos nucleares que es característico de los agentes que dañan el ADN típicos utilizados en la terapia del cáncer, como la irradiación y los compuestos de platino. Además, incluso las dosis más pequeñas que se probaron todavía inhibieron la proliferación celular en el ensayo de formación de colonias, lo que sugiere la presencia de componentes de acción prolongada que inhiben la proliferación de células cancerosas a dosis bajas del extracto. A dosis tan bajas, las mitosis aberrantes no fueron significativamente evidentes, lo que sugiere un mecanismo de actividad potencialmente diferente a dosis bajas en comparación con dosis altas, donde el daño del ADN y las mitosis aberrantes eran evidentes. Por lo tanto, Se justifica investigar el potencial terapéutico (dosis alta) o quimiopreventivo (dosis baja) del extracto y sus componentes. Sin embargo, actualmente se desconoce si las mismas vías involucradas en DDR también son responsables de la actividad antiproliferativa del extracto observada a dosis más bajas. Es posible que otras vías de supervivencia se inhiban a dosis más bajas sin inducir un DDR fuerte. Los ingredientes que inhiben la supervivencia a largo plazo de las células cancerosas tratadas deben examinarse en detalle, ya que las dosis bajas de Es posible que otras vías de supervivencia se inhiban a dosis más bajas sin inducir un DDR fuerte. Los ingredientes que inhiben la supervivencia a largo plazo de las células cancerosas tratadas deben examinarse en detalle, ya que las dosis bajas de Es posible que otras vías de supervivencia se inhiban a dosis más bajas sin inducir un DDR fuerte. Los ingredientes que inhiben la supervivencia a largo plazo de las células cancerosas tratadas deben examinarse en detalle, ya que las dosis bajas deLos compuestos de R. graveolens pueden ser beneficiosos como agentes quimiopreventivos en sujetos de cáncer de alto riesgo.
La inducción de DDR por el extracto de R. graveolens plantea una pregunta sobre el papel de DDR como punto de control en el contexto actual, es decir, si los compuestos de R. graveolens serían adecuados para la quimioprevención o como sensibilizadores a la quimioterapia. El DDR activado sirve como un punto de control para permitir que las células dañadas reparen su ADN o para inducir la apoptosis o la senescencia, como una línea de defensa primaria contra la transformación neoplásica de las células ( 28 ). Aunque se sugiere que el inicio del DDR es un punto de control para prevenir la carcinogénesis, el DDR persistente puede tener resultados indeseables a través de la señalización inflamatoria crónica ( 29 ) que, a su vez, puede promover la transformación carcinogénica. Para abordar estos problemas, es necesario identificar los ingredientes bioactivos enExtracto de R. graveolens para delinear aquellos con actividades inductoras de DDR y aquellos con efectos potenciales sobre otras vías de señalización de supervivencia. Por otro lado, se podría esperar que la propiedad inductora de DDR del extracto de R. graveolens sensibilice las células cancerosas a los fármacos quimioterapéuticos que se dirigen a las vías de señalización de supervivencia. Recientemente, la inhibición de CYP3A por compuestos en pomelos se utilizó para reducir la dosis terapéutica del fármaco anticanceroso rapamicina ( 30 , 31 ), lo que ilustra el uso potencial de compuestos naturales como adyuvantes o suplementos de fármacos terapéuticos convencionales. Por otro lado, la propiedad inductora de DDR de R. graveolensEl extracto también debe alertar sobre los riesgos potenciales del uso prolongado de altas dosis de preparaciones medicinales de la hierba.
Las especies de Ruta y muchas otras plantas como la toronja, el perejil, el apio y la chirivía contienen un grupo de fitoquímicos llamados furanocumarinas (furocumarinas) que se han asociado con la fitofotodermatitis ( 4 , 8 , 32 ) o el efecto del jugo de toronja ( 33 , 34 ). . Los efectos fototóxicos de los compuestos de furanocumarina se han asociado con la aplicación tópica de productos que contienen los compuestos, seguida de la exposición a fuentes de luz ultravioleta ( 4 , 5 , 35 ). Sin embargo, las bioactividades independientes de la fotoactivación de estos compuestos, incluida la inducción de p53 e in vivoSe ha informado inhibición de CYP450 ( 14 , 36 ). Por lo tanto, se necesitan más estudios para identificar las moléculas individuales, las dianas moleculares para cada uno de los compuestos bioactivos en R. graveolens y para sugerir las condiciones racionales bajo las cuales los productos vegetales o los compuestos aislados podrían usarse de manera beneficiosa. Dado que las células tratadas no fueron expuestas a fuentes conocidas de luz UV en este estudio, se propone que el DDR y los efectos antiproliferativos que se informan aquí son independientes del tipo de fotofitotoxicidad inducible por UV. Se ha informado de un resultado similar para el bergapten, una de las furanocumarinas fotoactivables, donde el compuesto indujo la vía p53 y la apoptosis de las células de cáncer de mama independientemente de la fotoactivación (14 ). En conclusión, los datos actuales sugieren que los extractos de la hierba medicinal y culinaria R. graveolens contienen compuestos bioactivos que activan vías de señalización molecular específicas e interfieren significativamente con la supervivencia y proliferación de las células cancerosas, lo que justifica más investigaciones.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a Bert Vogelstein y Leslie Wilson por el amable suministro de líneas celulares, a Cesar Fermin por su ayuda con la microscopía y la imagen digital, a Clayton Yates por su ayuda con la microscopía confocal, a Sibyl Bowie por las sugerencias y la ayuda editorial durante la preparación del manuscrito. La investigación en el laboratorio de TS está respaldada por la subvención SC2CA138178 de NIH / NCI / NIGMS. El apoyo a TT se realizó mediante los números de subvención 3P20MD000195 (NIH / NCMHD) y U54CA118623 (NIH / NCI). Agradecemos el apoyo de investigación de verano del Centro de Excelencia CVMNAH (subvención # 5D34HP00001-20-00) (a AW, TY y TS).